Diagnostic parasitaire

Introduction
Le diagnostic parasitaire peut être orienté par l'interrogatoire préliminaire du malade qui permettra de comprendre le contexte épidémiologique de la survenue de la parasitose à savoir le mode de vie rural ou urbain, la profession, les habitudes alimentaires, les contacts avec les animaux domestiques ou d'élevage, les loisirs (jardinage, manipulation de fumier), la notion de voyage dans des zones d'endémie car de nombreuses maladies parasitaires sont inféodées à certaines régions du globe…etc.



Le diagnostic peut être également orienté par les signes cliniques, l'imagerie ou par des examens complémentaires qui révèlent des perturbations biologiques et hématologiques.

A titre d'exemple, on peut suspecter une helminthiase devant une hyperéosinophilie, et une ankylostomiase ou une bothriocéphalose devant une anémie.



Le diagnostic parasitaire de certitude est basé sur la mise en évidence directe du parasite, avec ou sans coloration, dans un produit biologique tel que les selles, les urines, le sang, la peau, les expectorations ou les crachats, les sécrétions vaginales, le liquide duodénal, le liquide broncho-alvéolaire, le liquide céphalorachidien, les produits de biopsie ou de ponction, le pus ou les cheveux.



Le diagnostic d'une parasitose peut se faire indirectement par la détection d'anticorps. Ce diagnostic immunologique a tout son intérêt pendant la phase de migration larvaire ou lors des impasses parasitaires. Il complète la recherche directe, parfois aléatoire, du parasite et permet de suivre l'efficacité d'un traitement antiparasitaire.

Lorsque l'examen direct s'avère négatif, la mise en culture du produit biologique sert à mettre en évidence le parasite dont l'identification permettra le diagnostic parasitaire.

Le diagnostic des maladies infectieuses s'est enrichi récemment de la technique de la PCR (pour Polymerase Chain Reaction). Mise au point entre 1983 et 1985 par le biochimiste Kary Mullis (prix Nobel 1993), cette technique d'amplification de l'ADN utilise l'ADN polymérase, une enzyme capable de répliquer rapidement un fragment d'ADN et permet des identifications plus rapides et plus sensibles
Examen parasitologique des selles : L'examen parasitologique des selles permet de mettre en évidence les parasites qui colonisent le tube digestif de l'homme.



Le prélèvement




Avant l'examen, il faut recommander au malade de suivre pendant deux ou trois jours, un régime pauvre en résidus (ni fruits, ni légumes verts) et d'éviter la consommation de foie de bovin, ou d'ovins pouvant apporter des œufs de transit.
Il faut également arrêter de prendre des médicaments tels que le bismuth, le charbon , les mucilages et l'huile de paraffine qui surchargent les préparations microscopiques et gênent considérablement le coprologiste, ainsi que les antibiotiques et les sulfamides , si cela est possible, qui nuisent aux protozoaires.



Les selles seront émises au laboratoire, recueillies dans un récipient propre et sec et examinées immédiatement car les trophozoïtes perdent rapidement leur mobilité.


Lorsque l'examen extemporané n'est pas possible, on peut conserver les selles dans le formol à 10% ou le Merthiolate-Iode-Formol (MIF).





L'examen direct




L'examen direct est le seule examen qui permet de garder la vitalité des parasites.

Il comprend:

un examen macroscopique qui doit être pratiqué systématiquement avant tout examen microscopique. Il permet de noter la couleur, la consistance et la présence de sang, de mucosités de pus ou de certains parasites (anneaux de ténia, oxyures, ascaris...),

et un examen microscopique qui met en évidence les kystes et les formes végétatives de protozoaires ainsi que les œufs et les larves d'helminthes.


Un seul examen est sans intérêt car l'émission des kystes est discontinue et la ponte des helminthes est irrégulière. Il est donc important de répéter les examens trois jours consécutifs ou à quelques jours d'intervalle.



Technique


Déposer une goutte d'eau physiologique sur une lame porte objet propre.
Prélever à l'aide d'un agitateur un fragment des selles en plusieurs endroits.
Réaliser un mélange homogène.
Recouvrir d'une lamelle.
Observer au microscope au grossissement 100 puis 400.


Remarques

Éviter un excès de selles pour une préparation transparente et un excès d'eau pour ne pas souiller le microscope. L'excès de liquide peut être épongé avec du papier absorbant. Si la selle est liquide, l'ajout d'eau n'est pas nécessaire.

L'eau du robinet est hypotonique et permet donc la lyse de Blastocystis hominis, de Dientamoeba fragilis et de Pseudolimax butchlii alors que les kystes restent intacts.

Les cristaux de Charcot-Leyden en aiguille de boussole évoquent une helminthiase.

Test de Graham ou Scotch test anal


Ce test permet de mettre en évidence, dans les plis anaux, les œufs d'oxyures, les embryophores de ténias et parfois les œufs de Schistosoma mansoni.

Technique


Appliquer une cellophane adhésive repliée en U sur le fond d'un tube à essais au niveau de la marge anale le matin avant toute toilette intime.

Apposer le scotch sur une lame porte objet.

Observer au grossissement 100 puis 400


Les techniques de coloration

Coloration au lugol


Cette coloration est facile et extemporanée. Elle permet le diagnostic différentiel des amibes.

Elle colore en brun les vacuoles iodophiles et les noyaux.



Technique



Ajouter une goutte de lugol au montage préparé pour l'examen direct.

Observer au microscope au grossissement 100 puis 400.



Réactifs




Lugol

Iode
1g

Iodure de potassium
2g

Eau distillée
100ml




Durée de conservation: 3 semaines dans un flacon opaque.


Coloration au MIF



Le MIF est un produit conservateur des formes végétatives des protozoaires et qui permet également de colorer les noyaux d'amibes.


Réactifs

Teinture de merthiolate

Merthiolate
0,10g
Éosine
2g
Alcool à 90°
52,5ml
Acétone
10ml
Monoéthanol amine
0,1g
Eau distillée
100ml



Réactif A

Glycérine
5ml
Formol
25ml
Teinture de merthiolate
200ml
Eau distillée
250ml

Durée de conservation: plusieurs mois.

Réactif B

Iode
0,5g

Iodure de potassium
1g

Eau distillée
10ml


Durée de conservation: 3 semaines dans un flacon opaque.

Technique




Remettre au malade deux tubes à hémolyse et un agitateur.
Tube A contenant 2,35ml du réactif A
Tube B contenant 0,15ml du réactif B
Verser le contenu du tube A dans le tube B.
Prélever une noisette de selles et l'introduire dans le tube B.
Homogénéiser à l'aide de l'agitateur.

Prélever à l'aide d'un agitateur un peu de selles

Étaler entre lame et lamelle.
Observer au microscope au grossissement 100 puis 400.


Coloration de Ziehl Neelsen modifiée par Henricksen et Pohlenz


Cette coloration est indispensable pour mettre en évidence les oocystes de Cryptosporidium.


Réactifs


Carbolfuchsine

Solution A

Fuchsine basique
1g

Éthanol à 95%
10ml

Dissoudre en broyant dans un mortier.

Solution B

Phénol cristallisé
5g

Eau distillée
100ml

Mélanger les solutions A et B.
Laisser reposer pendant 8 jours.
Filtrer et conserver à température ambiante.




Bleu de méthylène

Bleu de méthylène
0,3g

Eau distillée
100ml

Filtrer


Acide sulfurique à 5%.


Technique

Fixer le frottis mince de fèces par le méthanol.
Colorer pendant une heure par la solution de fuchsine.
Rincer rapidement à l'eau du robinet.
Différencier pendant 30 secondes par l'acide sulfurique.
Rincer et contre-colorer au bleu de méthylène pendant une minute, ou au vert malachite à 5 % pendant 5 minutes.
Rincer et examiner à l'immersion.


Coloration par l'auramine

Réactifs

* Auramine

Solution S1: 0,1g d'auramine + 10 ml d'éthanol à 95%.

Solution S2: 3 ml de phénol + 87 ml d'eau distillée.

Mélanger S1 et S2.

Conserver dans un flacon opaque.



* Alcool chlorhydrique:

99,5 ml d'éthanol à 70% + 0,5 ml d'HCl (1N).



* Permanganate de potassium:

0,5 g MnO4K + 100 ml d'eau distillée.



Technique

- Préparer un frottis mince de fèces,

- Laisser sécher pendant 24 heures à la température ambiante,

- Colorer la lame pendant 15 minutes par l'auramine,

- Rincer à l'eau distillée,

- Décolorer pendant 2 minutes par l'alcool chlorhydrique,

- Rincer à l'eau distillée,

- Contre-colorer pendant 3 minutes par la solution de permanganate de potassium,

- Rincer à l'eau distillée,

- Laisser sécher,

- Lecture en ultra-violet au grossissement (Gx1000).





Technique de Van Gool




Cette coloration fluorochromique permet de mettre en évidence les spores des microsporidies dans les selles.

C'est une technique d'orientation à l'uvitex 2B200 qui rend la chitine fluorescente aux rayons ultra violets.



Réactifs




Uvitex 2B200

Préparer une solution à 1% dans un tampon PBS pH 7.4

Durée de conservation: 3 mois dans un flacon opaque à +4°C.

Bleu Evans

Solution de Bleu Evans à 1% dans du tampon PBS




L'étalement de selles est fait sur lame à spot de 1.3 cm de diamètre.



Technique




Filtration des selles diluées sur tamis (diamètre des mailles : 50 microns).
Centrifuger pendant 5 minutes à 3200 t/mn.
Jeter le surnageant et remettre le culot en suspension dans du PBS (pH=7.4), ou dans de l'eau distillée.
Étaler 10 microlitres de cette dilution sur lame de verre.
Sécher les lames et fixer au méthanol pendant 5 mn
Recouvrir l'étalement de la solution Uvitex 2B200 et laisser agir pendant 15 mn.
Rincer à l'eau distillée.
Recouvrir l'étalement de la solution de bleu Evans à 1 % pendant 5 mn
Rincer à l'eau distillée et laisser sécher.

Observer à l'objectif 100 au microscope à fluorescence équipé d'un dispositif de lumière photonique (filtre d'excitation = 355 à 425 nm, filtre de suppression ou d'émission = 460 nm)



Remarques

Toute la coloration doit être effectuée à l'abri de la lumière.

Lors de la lecture, une exposition sous lumière photonique est nécessaire: les bactéries deviennent réfringentes, alors que les spores de microsporidies deviennent invisibles ou floues.




Technique de Weber modifiée




Cette coloration trichromique est utilisée pour la recherche des microsporidies dans des biopsies ou des selles.

Elle permet de confirmer la technique précédente de Van Gool.



Réactifs




Colorant de Weber

Mélanger dans un bêcher

Chromotrope 2R
6g

Fast green
0,6g

Acide phosphotungstique
1,4g

Ajouter 3 ml d'acide acétique glacial
Laisser reposer 30 mn à l'abri de la lumière

Ajouter progressivement 100 ml d'eau distillée et déposer la préparation sur agitateur magnétique 15 mn.




Alcool acide 90°

Enlever 100ml à 1 litre d'alcool éthylique absolu et remplacer par 100 ml d'eau distillée.

Enlever de ce mélange 4,5 ml et remplacer par 4,5 ml d'acide acétique.




Éthanol à 95°




Technique




A partir d'un culot de selles concentré par la technique de Ritchie, filtrer le mélange selles-formol à 10% sur filtre à 50 microns.

Ajouter l'éther au 1/3 et agiter.

Centrifuger, jeter le surnageant.

Reprendre le culot dans du PBS et agiter.

Déposer 10 microlitres de suspension de selles sur une lame.
Laisser sécher les lames à l'étuve.
La solution colorante est chauffée préalablement pendant 2 heures à 50°C à l'étuve et doit être maintenue à cette température pendant toute la coloration.
Plonger les lames pendant 10 mn dans le colorant (qui se trouve dans l'étuve à 50°C).
Rincer rapidement à l'eau.
Différencier 10 secondes dans un bac d'alcool acide en agitant légèrement.
Rincer rapidement à l'éthanol à 95°, le jeter.
Plonger 5 mn dans un second bac d'éthanol à 95°.
Laisser sécher les lames et observer à l'objectif 100 à immersion.



Les spores sont colorées en rouge ou rouge fuchsia sur fond vert, de forme ovoïde avec une vacuole excentrée.


Pour les biopsies, réaliser des empreintes sur des lames.





Les techniques d'enrichissement




Ces techniques permettent de concentrer les éléments parasitaires trop rares pour être décelés à l'examen direct.



Technique de Ritchie




La concentration est obtenue en combinant la sédimentation par centrifugation et l'élimination des résidus de la digestion par l'action dissolvante de l'éther éthylique.



Réactifs




Solution de formol à 10%.

Solution d'éther éthylique.






Technique



Diluer une noisette de selles dans une solution de formol à 10%.
Tamiser à l'aide d'une passoire avec des pores fines.
Ajouter l'éther au 1/3.
Agiter vigoureusement jusqu'à l'obtention d'une solution homogène.
Centrifuger à 1500 tours/min pendant 2 minutes.
Rejeter le surnageant.
Examiner le culot entre lame et lamelle aux grossissements 100 puis 400.





Technique de Kato




Elle permet de mettre en évidence les œufs d'helminthes et consiste à examiner un étalement épais de matières fécales après l'action d'une solution éclaircissante.



Réactifs




Solution éclaircissante

Glycérine
100ml

Eau distillée
100ml

Vert malachite à 3%
1ml




Technique




Découper des rectangles de cellophane de 2 x 5 cm et les immerger pendant au moins 24 heures dans la solution éclaircissante.
Réaliser un frottis épais de matières fécales sur une lame porte objet.
Recouvrir la préparation par un rectangle de cellophane imprégnée.
Retourner la préparation et l'écraser sur la paillasse recouverte de papier filtre.
Maintenir sous une lampe pendant 10 à 15 minutes pour éclaircir la préparation.
Rechercher les œufs d'helminthes au grossissement 100.


Remarque
Cette technique est inutilisable si les selles sont liquides.





Technique de Baermann




Elle repose sur l'hygrotropisme et le thermotropisme positifs des larves rhabditoïdes d'anguillules.



Technique




Monter sur un entonnoir un embout de caoutchouc fermé par une pince.
Disposer sur cet entonnoir un tamis et une couche de gaze dont les coins seront rabattus.
Placer l'entonnoir sur un portoir adapté et y déposer une noix de selles.
Ajouter de l'eau tiède jusqu'à l'immersion des matières.
Après 4 h, ou au mieux 24 h, soutirer l'eau en desserrant la pince.
Centrifuger 2 à 3 minutes à 2000 tours/mn et examiner le culot.
Les larves sont aisément repérables au faible grossissement grâce à leur mobilité.





Technique de flottaison de Willis




Cette technique utilise la propriété que possèdent certains œufs d'helminthes de flotter à la surface et d'adhérer au verre.



Technique




Délayer 1 à 2 g de selles dans 20 ml d'une solution saturée de NaCl à 25% puis tamiser.
Remplir complètement un tube à essai de façon à former un ménisque bombé.

Dépose une lamelle à la surface du tube.
Après une heure, retirer la lamelle et déposer la sur une lame porte-objet.
Observer au microscope au grossissement 100 puis 400.



Technique de Faust et coll




Cette technique utilise une solution de sulfate de zinc à 33%.



Technique



Délayer les selles dans 5 fois leur volume de chlorure de sodium à 9 p mille.
Tamiser et verser 2 ml de la dilution dans un tube à centrifuger qu'on remplit d'eau.
Centrifuger pendant une minute à 3000 tours/min.
Laver le culot jusqu'à l'obtention d'un surnageant limpide.
Remettre le dernier culot en suspension dans la solution de sulfate de zinc.
Centrifuger une dernière fois pendant 45 secondes.
Prélever en surface avec une anse de platine ou une pipette Pasteur.

Observer au microscope au grossissement 100 puis 400.





Technique de Janeckso-Urbanyi




Elle utilise une solution d'iodomercurate de potassium.



Réactifs




Solution iodomercurate

Biiodure de mercure
150g

Iodure de potassium
110g

Eau distillée
400ml




Technique




Délayer 3 à 5 g de selles dans 20 ml de la solution d'iodomercurate.
Tamiser et centrifuger la suspension pendant 3 minutes à 2 500 tours.
Prélever immédiatement en surface à l'aide d'une pipette Pasteur.

Observer au microscope au grossissement 100 puis 400.



Remarque
Il est recommander d'utiliser un examen direct et deux techniques de concentration, une technique pour les protozoaires et une autre pour les helminthes.





Coproculture




La coproculture des protozoaires nécessite des milieux spéciaux tel que le milieu diphasique pour culture de protozoaires de l'Institut Pasteur.
Ce milieu est constitué par :
- un support solide (sérum de cheval coagulé en position inclinée),
- une phase liquide (sérum de cheval étendu de 6 parties de solution de Ringer)
- et un aliment figuré (amidon de riz).



Technique




Inoculer le fond du tube avec une petite parcelle de matières fécales.
Examiner au bout de 24 à 48 heures d'étuve à 37°C (25°C pour Trichomonas hominis et Balantidium coli).
Prélever au fond du tube, au contact de l'amidon; en raclant la surface du sérum coagulé.





Pour les helminthes, la coproculture est employée pour le diagnostic de l'anguillulose lorsque les techniques d'enrichissement ne donnent pas de résultats.
Elle s'effectue soit en boîte de Pétri, soit en tube.



Technique




En boîte de Pétri
Découper plusieurs morceaux de papier filtre en une bande moins large que la longueur d'une lame porte-objet.
Enrouler cette bande autour de 3 lames mises l'une sur l'autre.
Placer l'ensemble dans une boîte de Pétri contenant de l'eau mais sans l'immerger totalement.
Étaler une couche de matières fécales à la surface du papier filtre.
Fermer la boîte.
Incuber à l'étuve à 27°C.


En tube
Découper des languettes de papier Wattman de largeur inférieure au diamètre d'un tube à essai.
Étaler une quantité de selles sur une face.
Introduire le papier dans le tube, extrémité libre vers le bas et mettre de l'eau dans le fond du tube en prenant soin que le niveau n'atteigne pas la partie recouverte de matières fécales.
Fermer à l'aide d'un coton cardé.
Incuber à l'étuve à 27°C.

2 à 3 jours après la mise en culture, recherchées les larves dans l'eau après centrifugation.
Remettre de l'eau et examiner de nouveau au bout de 8 jours pour mettre en évidence les larves d'anguillules de deuxième génération.

Méthode de Mac Master




La méthode de Mac Master est une méthode quantitative basée sur le principe de la flottation.
Elle consiste à compter le nombre d'éléments parasitaires contenus dans 0,30 ml d'une suspension de matière fécale diluée au 1/15ème.

Elle nécessite l'utilisation d'une lame de Mac Master qui est composée de deux compartiments adjacents ayant un volume de 0,15 ml chacun et séparés par une cloison. Le plafond de chaque compartiment est divisée en 6 cellules de 1,7 mm de largeur. Technique




- Homogénéiser le prélèvement au moyen d'un mortier et d'un pilon.
- Peser précisément 1 gramme de matières fécales.
- Ajouter à ce prélèvement 14 ml d'une solution de flottation et homogénéiser le mélange à l'aide d'un agitateur.
- Prélever un échantillon de la suspension à la seringue.
- Remplir à l'aide d'une seringue de 1 ml chacun des deux compartiments de la lame de Mac Master avec la suspension.
- Poser la lame sur la platine du microscope et attendre pendant 5 min environ que les œufs remontent.
- Observer à l'objectif x10.
- Faire défiler successivement les six cellules et compter le nombre total d'œufs.



Calcul du nombre d'oeufs par gramme de fèces (OPG)
Chaque cellule a un volume connu de 0,15 ml donc, comme la solution est diluée au quinzième, le nombre d'œufs comptés est celui contenu dans un centième de gramme de fèces. Pour obtenir le nombre d'œufs par gramme, on multiplie le résultat obtenu lors du comptage sur un compartiment par un facteur 100.

Il est conseillé de compter les deux compartiments, le facteur de multiplication sera alors de 50.
OPG = nombre d'œufs dans les deux compartiments x 50


Remarque

Afin d'obtenir un résultat statistiquement significatif, il est recommandé de pratiquer plusieurs lectures de lames et d'en effectuer la moyenne.


Limites de la technique
La lecture ne peut se faire qu'avec l'objectif x10. Les éléments de très petite taille ne pourront donc pas être identifiés et donc comptés.
L'analyse quantitative des larves ne peut pas se faire à cause de leur mobilité qui les entraînent vers le bas de la cellule alors que la mise au point se fait dans la partie supérieure.



Examen parasitologique des urines



Cet examen permet de mettre en évidence les œufs de Schistosoma hæmatobium, les formes végétatives de Trichomonas vaginalis et, plus rarement, les microfilaires.



Les œufs de Schistosoma hæmatobium




Le prélèvement




La recherche des œufs de Schistosoma hæmatobium s'effectue dans les urines émises le matin, sur la totalité des urines de la journée, ou après un effort (marche, sautillements sur place, flexions) en forçant en fin de miction afin de détacher les œufs de la muqueuse vésicale.



Sédimentation




Laisser sédimenter les urines.
Prélever 20 ml dans le fond du flacon.
Centrifuger à faible vitesse dans un tube conique.
Prélever 1 ml du culot de centrifugation et le verser dans un verre de montre.
Examiner la préparation à la loupe ou entre lame et lamelle à faible grossissement.



Concentration




Agiter le flacon de prélèvement.
Prélever 10 ml d'urine dans le fond du flacon et le verser dans un tube à centrifugation.
Centrifuger pendant 2 minutes à 2000 tours par minute.
Prélever le culot à l'aide d'une pipette pasteur, le verser dans un verre de montre.
Examiner la préparation à la loupe ou entre lame et lamelle à faible grossissement.



Lorsque l'examen est différé, les urines doivent être conservées en ajoutant 5 ml d'un liquide conservateur.



Liquide conservateur

Formol
10ml

Glycérine
10ml

Eau distillée
80ml






Filtration




La recherche des œufs de Schistosoma hæmatobium peut également se faire par filtration des urines.

Mettre l'urine dans une seringue de 50 ml.
Pousser l'urine à travers une chambre de filtration contenant un filtre.
Placer le filtre entre lame et lamelle et observer au faible grossissement.



Les œufs éliminés par les urines peuvent être vivants, morts, ou calcifiés.
Afin d'apprécier la viabilité des œufs, on peut réaliser le test d'éclosion.



Test d'éclosion




Le culot est placé dans un récipient contenant de l'eau.

L'éclosion des œufs et la libération des miracidies s'effectue à une température entre 28- 30°C.
Rechercher, à la surface de l'eau, ces miracidies à la loupe.



Remarque
Les oeufs calcifiés continuent à être éliminés longtemps après la guérison.





Trichomonas vaginalis




Les formes végétatives de Trichomonas vaginalis peuvent être déceler dans les urines du premier jet.

Centrifuger les urines et examiner le culot à frais ou coloré par le May-Grünwald-Giemsa ou le RAL 555.





Les microfilaires




Toutes les filaires peuvent être décelées dans les urines après la prise de Notézine.
Les microfilaires de Wuchereria bancrofti et d'Onchocerca volvulus peuvent être observées en cas de lymphochylurie.
Celles de l'espèce Loa loa peuvent passer en même temps que les hématies au niveau du rein lors d'altérations glomérulaires importantes.


L'examen se fait dans le culot de centrifugation.



Remarque
La microfilarurie est permanente car il n'y a pas de périodicité dans l'élimination des microfilaires.



Examen parasitologique du sang



Tous les compartiments sanguins peuvent être colonisés par les parasites: les hématies par Plasmodium sp et Babesia sp, les leucocytes par le toxoplasme et les leishmanies, et le plasma par les trypanosomes et les microfilaires (Loa loa, Wuchereria bancrofti, Brugia malayi, Mansonella perstans et Mansonella ozzardi).



Le prélèvement




Le sang est recueilli par piqûre de la pulpe du doigt à l'aide d'un vaccinostyle à partir du sang capillaire ou par ponction veineuse sur anticoagulant.
Pour la recherche du Plasmodium, le prélèvement doit se réaliser au moment du clocher thermique lorsque le nombre de parasites est maximum dans le sang périphérique.

Pour les microfilaires, l'espèce Loa loa est diurne et particulièrement abondante dans le sang périphérique le jour. Sa recherche doit s'effectuer entre 12 et 14 heures.
L'espèce Wuchereria bancrofti est nocturne et doit être recherchée la nuit entre 10 heures du soir et minuit.

La variété pacifica de Wuchereria bancrofti est apériodique alors que les filaires non pathogènes n'ont pas de périodicité.



L'examen direct à l'état frais




L'examen microscopique direct d'une goutte de sang entre lame et lamelle peut déceler les trypanosomes et les microfilaires vivants et mobiles.



Le frottis mince




Plonger le frottis pendant 5 minutes dans le méthanol
Colorés les lames au Giemsa 3 à 5% pendant 45 minutes.
Rincer à l'eau courante et sécher.
Examiner au microscope à l'immersion et au grossissement 1000.



Remarques
Dans le diagnostic d'urgence du paludisme et dans les enquêtes sur le terrain, il est possible d'utiliser la coloration rapide à l'aide du coffret RAL 555 qui comporte une solution de méthanol, une solution d'éosine aqueuse et une solution de bleu de méthylène. Le diagnostic d'espèce ne sera fait qu'après avoir examiné un certain nombre d'hématies parasitées.
Dans le diagnostic des microfilaires, il est préférable de faire un frottis un peu épais et de rechercher dans la queue de l'étalement où les éléments parasitaires sont souvent entraînées.



La goutte épaisse




Il s'agit d'une microtechnique d'enrichissement qui permet d'observer sur une petite surface beaucoup plus de sang que sur un frottis.



Technique




Déposer une goutte de sang au centre de la lame.
Tourner régulièrement dans la goutte tout en l'étalant, pendant deux minutes, à l'aide de la pointe d'un vaccinostyle ou le coin d'une lame pour défibriner le sang.
Mettre la lame à l'abri des poussières et des mouches pendant 4 à 24 heures selon la température ou mettre à l'étuve à 38-40 °C pendant 5 minutes.
Plonger la lame pendant 5 à 10 minutes dans un verre à pied contenant de l'eau du robinet jusqu'à ce que la préparation soit claire (hémolyse complète).
Retirer la lame et la laisser sécher à plat.
Fixer par le méthanol.
Colorer par une solution de Giemsa pendant 20 minutes.
Rincer à l'eau, laisser sécher et examiner à l'immersion.



Remarques
Une technique plus simple consiste à recouvrir la lame de Giemsa dilué à raison d'une goutte par ml, laisser agir pendant 1 heure, laver à l'eau et sécher.
La coloration rapide à l'aide du coffret RAL 555 peut être utilisée.



Le frottis mixte




Le frottis mixte associe le frottis mince et la goutte épaisse.



Technique



Déposer une très petite goutte de sang au centre d'une lame porte-objet et l'étaler en allant vers une extrémité.
Réaliser une goutte épaisse à l'autre extrémité selon la technique précédemment décrite.
Après l'hémolyse de la goutte épaisse, fixer au méthanol puis colorer par le Giemsa.

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merciiii