le labo virtuel , on va se regaler les bio ! ! !

par biofella Sam 2 Mai - 18:39

je commence par le dosage des sucres :cheers: : 1e méthode simple pr faire le dosage des sucres en cas ou vs n trouvez ps le réactif
donc cette méthode est faite par le Mr Dubois 1956 kdimaaa mais efficace
spectrophotomètre longueur d onde λ= 488nm kain chez ts les labo des analyses privé!! il faut juste demander
des concentration de glucose allons de 0% jusqu'à' 100% utilisée cmme gamme d étalonnage par ex: 0-20-40-60-80-100%
bon l protocole ykoul: 1mld'échantillon + 1ml de phénol + 5ml d' ac sulfurique (hadou kain partout mais des fois périmé ) aprs on laisse les tubes ( la gammes plus l'échantillon) 10 minute à température ambiante ensuite 15 minutes à 25°c (bain marie) et à la fin la lecture
vs tracez 1e courbe DO densité optique / concentration et bin c ts .... avec la courbe vs calculer la concentration de l'échantillon

NB: il faut porter l masque lors d la manip et lorsq vs ajter l ac sulfurique le tube devient chaud alrs .... faite attention
li mai3rfch cmmt préparer la gamme ... solution mère de 100% glucose men b3d diluer ds des tubes de 10ml selon la concentration . Have fun
:affraid:

par biofella Lun 4 Mai - 19:47

Je vous propose deux types principaux de milieu de culture:

Le milieu de type classique (seigle) qui pourra être utilisé éventuellement comme nouvel inoculum sur d'autre bocaux de seigle
Le milieu de type boulettes qui permet d'utiliser le four à micro-onde et est beaucoup selon certains, pour autant que vous disposiez d'un inoculum en solution !
Il existe également une alternative à l'utilisation de bocaux en verre : les sacs en plastique.

Je vous suggère d'utiliser le premier si vous désirez avoir de meilleurs rendements.

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Préparation du milieu de culture classique
Ce milieu sera constitué de seigle complet. Certains cultivateurs utilisent d'autres grains, comme par exemple, les mélange de graines pour oiseaux. Qu'importe. Apparemment tous les grains fonctionnent, mais le seigle est le plus utilisé car il ne colle que très peu à la cuisson. Vous pouvez choisir le grain que vous voulez pour autant qu'il ait cette propriété nécessaire.

Nettoyez soigneusement à l'eau claire vos bocaux de 1 litre.
Dans chaque bocal mettre :
200 ml de seigle complet (ce qui équivaut à environ 160 gr. selon l'humidité contenue dans le seigle)
200 ml d'eau distillée
Posez le couvercle sur l'ouverture en le vissant à peine.
Recouvrir le couvercle de papier d'allu. Le papier d'allu doit descendre jusqu'à environ 5 cm au dessous du bas du couvercle, de manière à empêcher les compétiteurs d'y pénétrer.
Stériliser durant 60 mn à la marmite, ne pas oublier d'y mettre 1-2 cm d'eau au fond.
Laisser refroidir lentement (très important) puis visser fermement les couvercles sans enlever le papier d'allu.
Vérifier que les pots n'ont pas de fissures : risque de coupure. Ces fissures sont dues à un brusque changement de température, la prochaine fois il faudra faire monter la température plus doucement et laisser refroidir gentiment.. Si il y a des fissures mais que le pot reste étanche, il est utilisable : il suffit de bien l'entourer de scotch de carrossier pour éviter qu'il ne casse à l'endroit des fissures. Mais il ne sera plus utilisable pour une prochaine stérilisation.
Vous devez obtenir des grains de seigles cuits, stériles et qui ne collent pas trop entre eux : lorsque vous secouez le pot les grains doivent bouger facilement; ne pas faire des amas. Les grains doivent aussi être " intacts ", c.a.d. qu'ils ne doivent pas avoir " explosés " avec la cuisson. S'ils ont explosés ou sont collés, essayez de mettre moins de 200 ml d'eau par pot. Procédez par tâtonnement.

N'essayez pas de mettre plus de 200 ml de seigle, en pensant remplir de manière plus optimale le pot, vous allez faire face à un plus grand nombres d'infections et à une pousse lente du mycélium due au manque de réserve d'oxygène que constitue la moitié vide du pot.

Vous pouvez préparer environ 6 pots.

Préparation du milieu de type boulette
Le principe de ce type de milieu est de mélanger de la farine de riz brun à un support constitué de boulette biologiquement inerte (constituées de minéraux).

Attention, vous devez prendre note que :

Ce milieu ne sera inoculable que par des spores ou du mycélium en solution !
Les bocaux (ou autres récipients) utilisés devront avoir une forme cylindrique (ou tronc de cône, la partie la moins large étant en bas) et l'ouverture ne devra pas constituer un goulet. En effet, le support deviendra rigide lorsque le mycélium l'aura envahit et il ne sera pas possible de le secouer (comme dans le cas du milieu classique) pour le casser. Etant rigide, il faudra qu'il puisse glisser hors du bocal en conservant sa forme originale. Sinon, vous devrez casser le bocal.
Dans le cas des Tupperware, il faut qu'ils soient le plus transparent possible de façon à pouvoir vérifier l'éventuelle présence de contaminants.
Comme cité dans le chapitre citant le matériel à acquérir, on a le choix entre deux genres de support boulette :

La vermiculite (terme anglais). Il s'agit apparemment de petits bouts de mica expansés qui servent à donner au terreaux à planter une meilleure capacité à retenir l'eau. Elle se présente sous la forme de petites boulettes blanches s'effritants facilement (du moins je le crois). Je n'ai pas essayer ce support, mais il est idéal, parait-il ...
Les boulettes d'argile expansé. De petite ou moyenne taille. Elles sont utilisée en hydroculture.
Préparation du substrat
Prenez une unité de mesure (un bol p.ex) et mélangez dans grand plat (saladier) propre, les ingrédients suivants :

2/3 de mesure de Boulette
1/4 de mesure de farine de riz brun
1/4 de mesure d'eau distillée
La consistance de la misxture obtenue doit être telle que lorsque vous en serez fortement une poignée dans votre mains, quelques gouttes doivent couler. Si telle n'est pas le cas ajouter de l'eau ou de la farine/vermiculite. Il faut donc que le substrat soit très humide mais pas trempe.

Remplissage du récipient et stérilisation
Si vous utilisez des bocaux :
A l'aide d'un marteau un d'un petit clou, percez quatre trous dans les couvercle, à environ 1-2 cm du bord. Ils doivent juste être assez gros pour que l'aiguille de la seringue puisse passer. Remplissez le bocal avec la mixture jusqu'à

Remplissez votre récipient jusqu'à 1-2 cm du bord.
Nettoyez les 1-2 cm supérieur du récipient, à l'intérieur et l'extérieure, de façon à enlever toute trace de farine. Ce point est important car cela empêchera les infections de ses développer
Remplissez les 1-2 cm restants avec des boulettes propres et séches.
Remettez le couvercle :
Dans le cas des bocaux : vissez simplement le couvercle à fond et recouvrez de papier d'allu jusqu'à 5 cm au dessou du bord.
Dans le cas des Tupperware : recouvrez de papier d'allu jusqu'à au moins 5 cm au dessous du bord. Essayez de le faire tenir en plaçant un élastique autour du récipient
Stérilisez à la marmite à vapeur durant 45 mn. et laissez refroidir lentement.
Une fois le substrat à température ambiante, vous pouvez passez à l'inoculation par la solution.

Utilisation du micro-onde pour la stérilisation
Un moyen de préparer de plus grand récipient est d'utiliser un four à micro-onde. Il faut procéder comme ci-dessus mais en remplaçant le papier d'allu ou le couvercle en métal des pots par autre chose ! En effet, il ne faut pas introduire de métal dans le four à micro-onde sous peine de l'endomager.

Voici un exemple : (que je n'ai pas encor testé!)

Utilisez un Tupperware de 15 cm de profondeur, qui supporte le micro-onde, ayant la plus grande taille possible.
Nettoyez-le à fond (y compris le couvercle) ou faite-le bouillir dans une grande marmite pendant 1 heure.
Remplissez-le de mixture de boulette jusqu'à 1-2 cm du bord. Puis jusqu'en haut avec des boulettes sèches.
Percez quatre trous dans le couvercle et mettez le en place.
Faites le cuire au micro-onde (position haute puissance) durant 8-10 mn. Attendez 15 mn et recomencez.
Placez des bandes adhésives sur chacun des quatre trous.
Laissez refroidir (dans le four ou un autre endroit propre) et procédez à l'inoculation.
Vous pouvez essayez d'utilisez du plastique (en anglais saran-wrap) pour emballer les aliments (qui résiste à la chaleur) en lieu et place de couvercle : Mettez le en place sans le tendre, n'y faite pas de trou, vous les ferez au moment de l'inoculation. Stérilisez puis mettez un élastique pour bien le tenir en place tendu.

A vous de faire des essais pour trouver le bon temps de stérilisation la bonne quantité d'eau de la mixture qui permette d'obtenir le meilleur résultat, à savoir une pousse rapide du mycélium et pas de contamination.

par biofella Lun 4 Mai - 19:49

Utilisation de sacs en plastique [Pending : Beta]
Ce paragraphe propose une variante qui vous permet de vous passer d'utiliser des bocaux en verre, si par exemple vous avez du mal à vous en procurer, si vous voulez faire une culture à plus grande échelle ou par simple curiosité technique.

Mon expérience de cette technique est encore limitée, puisque j'en suis aux stades des expérimentations, mais je tiens quand même à coucher tout ceci par écrit. C'est pour cela que ce paragraphe doit être considéré comme une version béta !

Les méthodes que je vais présenter suppose l'utilisation d'une simple boîte à innoculation et non d'un système évolué de filtrage de l'air, comme ceux montré dans les livres de P. Stamets. Pour cette raison, les résultats en terme de taux de contaminations peuvent forts bien être catastrophique.

La méthode que je compte appliquer comporte trois phases principales :

Introduction du seigle dans le sac. Fermeture 'hermétique' du sac (exepté un petit trou nécessaire pour la différence de pression lors de la stérilisation). Stérilisation.
Fermeture du petit trou -> hermétiquement
Innoculation puis fermeture hermétique
Il existe encore une variante à tout ceci : la fermeture hermétique peut soit être totale (en soudant le plastic) soit être uniquement imperméable aux contaminant et ainsi permettre les échanges gazeux nécessaire au mycélium. Ceci peut être réalise au moyen de filtre microporeux, disponible auprès du FRMC, je crois.

Je vais pour l'instant me contenter de décrire la première variante, à savoir la fermeture hermétique du sac.

Le matériel nécessaire
En plus du matériel normal détaillé en début de ce manuel, il vous faut :

Un appareil à sceller les sachets plastiques : entre 50 et 100 FS. Le dispositif permettant de faire un léger vide d'air n'est pas nécessaire.
Des sacs plastiques résistants à des température de 120 C ! Ils peuvent être en polypropylène (PP), en polyéthylène spécial (HDPE) mais pas simplement en polyéthylène (PE), ce dernier ne supportant pas du tout les température au dessus de 100 C. Il faut noter qu'il faudra un peu vous entraîner pour effectuer la soudure étant donné que l'appareil est justement conçu pour des plastiques en PE; l'utilisation de plastique en autre matière nécessitera peut-être un temps de soudure supérieur. (ce qui n'a pas l'air d'être le cas pour le HDPE).
Après quelques essais mon choix a été : sac plastique Tangan HDPE 20x30cm à la Migros.
Si vous ne parvenez pas à trouver le même vous devrez procéder à des essais dans la marmitte à vapeur.
Marche à suivre
Ce qui suit décrit l'utilisation du milieu classique, mais personne ne vous empèche d'utiliser le milieu de type boulette, dans ce cas vous pourrez remplir le sac entièrement, en laissant quand même une place pour effectuer la soudure.

Dans chaque sac HDPE 20x30cm, mettre 250 ml de seigle et 225 ml d'eau. Contrairement à la valeur pour les bocaux de 1 litre, je ne met pas la même quantité d'eau et de seigle, car plus la quantité de seigle introduite est grande moins il y a besoin d'eau.

Sceller hermétiquement les sacs
Découper un coin de manière à faire un petit trou, ce qui évitera que le sac n'explose à cause des différences de pressions dans la marmitte à vapeur.
Stérilisation. L'utilisation de sac permet de mieux remplir la marmitte. Si vous consatez que les sacs sont vraiments serrés les uns contre les autres, le temps de stérilisation devra peut-être être augmenté pour s'assurer que la température soit bien parvenue à coeur.
Refroidissement de la marmitte sans l'ouvrir.
Sortir un sac de la marmitte et sceller le petit trou, ceci dans une atmosphère semi-stérile (p.ex sprays javel en l'air et/ou emetteur d'ions négatifs). Répéter l'opération pour chaque sac. Il faut essayer de laisser asser d'air dans le plastique, mais il est impératif de s'arranger pour que cette air provienne de la marmitte. C'est le talon d'achile de cette variante; avec les filtres microporeux on n'a pas le risque de contamination qui résulte de cette nécessité de présence d'un volume suffisant d'air
Une fois que le sac de seigle est suffisamment refroidit, on peut passer à l'inoculation :

Ceci se déroule dans la boîte à innoculation. On va procéder à une inoculation liquide.

S'assurer que l'air soit le plus stérile possible, car lors de l'innoculation, il se peut que de l'air entre dans le plastique (ce qu'il faudra minimiser)
Mettre du mycélium en solution dans la seringue en verre stérilisée. Nettoyer avec un coton stérile pour nettoyer les plaies et de l'alcool l'endroit où vous allez procéder à l'innoculation (comme une piqure chez un homme!). Je vous suggère de piquer tout près d'un des coins, en prenant garde de percer une seule épaisseur de plastique. Passez la pointe de la seringue à la flamme introduisez-la dans le coins. Si la pointe est vraiment trop chaude, cela peut être difficile de faire un trou unique et discrèt : à vous de faire des essais. Injecter 1-3 ml. Puis mettez un bout de scotch sur le trous.
Procéder de même pour chaque sac et quand tous sont innoculés, utilisez l'appareil à sceller pour condamner le coin que vous venez d'utiliser.
Laissez incuber et observez si le taux de contamination est différent que lors de l'utilisation de bocaux.

Suggestion pour introduire de l'air
Pour que le mycélium se développe correctement dans le seigle et pour diminuer le risque de contamination bactérien (anaérobique) il faut vieiller à garder une certaine quantité d'air dans le récipient. Par exemple pour les bocaux et dans le cas du milieu classique, on laissait au minimum 1/3 d'espace vide. Dans le cas du milieu de type boulette, il n'y a pas besoin de laisser une telle réserve d'air, car l'air est contenue dans la strucure poreuse des boulettes.

Remarque : J'ai récemment fait quelques test et un des mes sacs plastiques a commencé à gonflé quelques jours après avoir été scellé (je ne l'avais pas inoculé). Il faut considérer ceci comme une infection.

L'aménagement d'une telle poche d'air dans les sacs plastique est problèmatique sachant que l'air introduit en plus est sans doute contaminé si aucune mesure spéciale n'est prise. Vous pouvez éventuellement ne pas vous préocuper de la quantité d'air que le plastique contient et observer si votre mycélium colonise le plastique pendant la même durée que lorsque vous utilisiez des bocaux. Si vous parvenez au succès, très bien, continuez sans vous soucier, mais peut-être que certaines espèces nécessiteront l'apport d'air pure.

Marche à suivre : (Je n'ai pas encore testé!)

Ces opération se passent dans la boîte à innoculation. Laissez la machine à scellé proche de la trappe de la boîte.
Choisir un des coins, repousser les grains de seigle contenu dans le sachet hors du coins. Nettoyer soigeusement le coin avec de l'alcool et un morceau de coton stérile et découper-le avec des sciseaux propres (passés à la flamme p.ex) de manière à former un trou d'environ 0.5 cm de diamètre.
Il s'agit maintenant d'utiliser un autre coton stérile imbiber d'alcool, en pinçant légèrement le coins et son trou à l'aide du coton et de l'autre main de faire enfler le plastique.
Une fois ceci fais, replier un peu le coin sur lui-même pour fermer provisoirement le plastique, passez le coin par la trappe et scellé-le à l'aide de l'appareil.
Problème: Peut-être que le fait que l'alcool pénètre dans le sachet sous forme de vapeur peu être nuisible pour le mycélium. La solution est l'utilisation de filtre microporeux, qui permettraient même de se passer de machine à sceller.

par biofella Lun 4 Mai - 19:50

[b] NB : chacun de nous (les bio ) doit savoir le faire

par Sali-bio Mar 5 Mai - 9:31

exelente idée * le labo virtuel * je te félicite pour ce topic
j'espère qu'il y aura beaucoup de participations .

par ABEUDE Dim 9 Aoû - 14:20

merci

par **biologiste** Lun 2 Nov - 15:35

Alors cette petite séance au labo?

- M'en parles pas, rien que d'y penser j'en ai la chair de poule...

- Pourtant

-Il n'y a pas de raisons, je sais. Tu as bien du me le dire au moins cent fois et pourtant, je suis sûre que ça va me faire mal et qu'en plus je vais avoir un bleu.

- Peut être, dans le fond, personne ne peut te garantir le contraire. Mais dis moi, sais tu comment ça se passe ?

- Tu es folle, je ne regardes pas.

- Alors, laisse moi t'expliquer. Déjà, tu auras échangé quelques mots avec la secrétaire à l'accueil pour qu'elle puisse créer ton dossier. (voir première visite)
Te voilà donc dans la salle de prélèvements, assise confortablement dans un fauteuil avec les accoudoirs réglables, tu observes la technicienne. C'est probablement une technicienne, c'est le cas de plus en plus souvent mais elle peut aussi être infirmière ou biologiste et elle peut bien sûr être il.
La première chose qu'elle fait, c'est se laver les mains avec un savon antiseptique. Puis elle prépare ses étiquettes. En fait, elles seront peut être déjà prêtes mais cela n'empêcheras pas la préleveuse de vérifier ses renseignements et éventuellement de te poser des questions.

- Du genre ?

- La date de tes dernières règles (pour dater une grossesse par exemple), ou ton nom de jeune fille (pour la carte de groupe), ou si tu prends des médicaments ou même des questions de l'ordre du régime alimentaire. en effet, certains aliments peuvent interférer avec des analyses mais le patient est prévenu à l'avance. Tu te vois repartir chez toi parce que tu as mal choisi ton menu de la veille au soir ?

- Je croyais que les analyses, c'était à jeun.

- En fait, le jeun strict n'est pas obligatoire pour toues les analyses. Et puis les biologistes ne sont même pas forcement d'accord entre eux. Le plus simple, c'est de se renseigner auprès de ton laboratoire ou de venir à jeun.

- Bon OK, et les tubes. Pourquoi, il y en a autant ?

- Là, il y a deux raisons à cela.
La première, toutes les analyses ne se font pas avec le même anticoagulant. Un exemple ? L'E.D.T.A. (ethylene dihydroxy tetraacetic acid, pour les curieux) - c'est celui dans les tubes violets- n'abîme pas les cellules alors on l'utilise en hématologie. Le citrate de sodium est un anticoagulant très rapide dont on peut facilement annuler l'effet, c'est pratique pour les tests qui étudient la coagulation justement. Par contre, il abîme les cellules alors on ne peut pas l'utiliser en hématologie.

Deuxième raison, les procédés d'analyses sont performants mais coûteux. Alors chaque laboratoire ne peut pas faire toutes les analyses. Mais, on ne peut pas non plus demander au patient d'aller se faire faire plusieurs prises de sang. Alors, les analyses qui ne sont pas faites sur place sont envoyées dans d'autres laboratoires. (Une forme de sous-traitance)

- Et maintenant, c'est le début du cauchemar

- N'exagérons rien. Même si c'est le moment le plus délicat.. Pour le préleveur.
Il faut trouver la veine à piquer. Heureusement le garrot aide, il les fait gonfler. Et si ça suffit pas, il existe des petits trucs. Comme frotter un peu le pli du coude ou le passer sous l'eau tiède, dans les deux cas, la chaleur locale fait gonfler les veines.
Bon, maintenant, elle sait où piquer, elle désinfecte la peau à l'alcool (souvent) et elle pique.

- Bah voilà quand même et une grosse aiguille fait mal

- Les grosses aiguilles, sûrement. Mais, les systèmes actuels n'ont pas de grosses aiguilles car les quantités à ponctionner sont de plus en plus faibles et le vide des tubes facilite le remplissage.

- Alors petite aiguille, petit trou qui fait pas mal.

- Exactement, la piqûre d'un moustique et puis c'est rapide. Il faut bien moins de temps pour le faire qu'il n'en faut pour l'expliquer.

- Parce que c'est fini ?

- Juste un tampon à appuyer sur le point de ponction, le garrot à enlever.

- Alors pas de bleus ?

- Non, pas en appuyant bien sur le tampon. Parce que le bleu c'est un saignement.

- OK, mais ta technicienne, ça se trouve, elle n'a jamais fait de prise de sang avant.

- Si en tout cas pas si tu vas dans un laboratoire privé. Car pour faire les prises de sang, il existe un diplôme spécial délivré par la DDASS qui contient entre autre un stage (fait en hôpital).

par sabra2 Jeu 17 Déc - 10:38

merciii

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preparation d'un milieu de culture "microbiologie" 2e et 3e année

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